活體成像研究底物之：

Coelenterazine 腔腸素（Rluc/Gluc報告基因）

— —活體成像研究/體外生物發光研究

基本描述：

腔腸素（Coelenterazine）是在水生生物中發現的一種發光基團（luminophore），是許多熒光素酶的作用底物，包括海腎熒光素酶（Renilla reniformis luciferase, Rluc），分泌型膜錨定熒光素酶（Gaussia luciferase, Gluc）和藪枝蟲熒光素酶（Obelia luciferase），和發光蛋白包括水母發光蛋白（Aequorin）的構成之一。前者的作用原理是以腔腸素為底物的熒光素酶，在含分子氧的條件下，氧化腔腸素產生高能量的中間產物，在此過程發射藍色光，光波長在450~480nm。不同于甲蟲（或螢火蟲）熒光素/熒光素酶（FLuc）系統不同，在含分子氧的條件下，還需要ATP和Mg²⁺的存在才能同時發光，光波長在550-570nm。由于生物發光信號和底物的差異，RLuc常常與FLuc聯合用于多報告基因研究。后者的作用原理是由脫輔基水母發光蛋白(Apoaequorin, APO)，分子氧和腔腸素組成的復合物形成活化的水母發光蛋白（Aequorin），一旦與鈣離子結合后，復合物結構被破壞，腔腸素被氧化生成高能產物（Coelenteramide），同時釋放出CO₂和藍色光。

腔腸素應用甚是廣泛，包括：1）活細胞或組織的鈣離子檢測；2）細胞或組織的超氧化物和過氧亞硝基陰離子（活性氧，ROS）化學發光檢測；3）基因報告基因檢測；4）動物活體檢測；5）ELISA和生物發光共振能量轉移（BRET）用于蛋白相互作用研究；6）藥物高通量篩選（HTS）。

腔腸素的幾個重要應用：

A、腔腸素/水母蛋白復合物用于鈣離子檢測（Coelenterazine/aequorin complex for calcium measurement）

A1、與傳統熒光法鈣離子濃度檢測的優勢

傳統熒光法鈣離子檢測工具琳瑯滿目，由紫外光激發到可見光激發的鈣離子檢測，比如，Fura-2激發光比率型熒光探針，Fluo-8最亮的鈣離子熒光探針，鈣離子檢測的靈敏度越來越高，也越來越方便，對儀器的要求也越來越低，那么腔腸素/水母蛋白系統對鈣離子檢測的優勢在哪呢？

● 鈣離子/水母蛋白復合物（Ca²⁺/aequorin complex）能檢測寬廣范圍的鈣離子濃度，從~0.1μM到＞100μM。

● 比熒光法探針的背景低，樣本本身不會發生自熒光。

● 雖然信號比熒光法低，但用成像儀能得到更高的信噪比。

● 水母蛋白復合物（aequorin complex）不會從細胞內泄露出來，因此能監測幾小時至數天內細胞鈣離子（Ca²⁺）濃度變化。

A2、工作原理

由脫輔基水母發光蛋白(Apoaequorin, APO)，分子氧和腔腸素組成的復合物形成活化的水母發光蛋白（Aequorin），一旦與鈣離子結合后，復合物結構被破壞，腔腸素被氧化生成高能產物（Coelenteramide），同時釋放出CO₂和藍色光（~466nm）。

圖1. 腔腸素/水母蛋白復合物用于鈣離子檢測的反應流程。

B、生物共振能量轉移（BRET for assaying protein-protein interactions）

B1、工作原理

BRET是一種高級的、無破壞性和以細胞為基礎的檢測技術，極其適合蛋白組學研究，包括受體研究和信號轉導途徑的路線圖。該技術是基于含生物發光熒光素酶和GFP變體融合蛋白之間的非放射性能量轉移。

大部分應用中融合供體是海腎熒光素酶（RLuc），而不是水母發光蛋白（Aequorin），目的是為了避免對水母來源GFP突變蛋白的內源性親和性。受體是黃色熒光蛋白（YFP），能夠提高良種發射光間的光譜區分。當供體和受體靠近，對腔腸素衍生物底物催化降解后產生的能量從熒光素酶轉移到YFP，從而使其釋放自身的熒光。BRET比值的計算顯示體內是否存在蛋白-蛋白相互作用，這種檢測方法有效去除光輸出波動可能造成數據的變動，比如由于反應體積、細胞類型、每孔細胞數目和/孔間信號延誤等引起光輸出波動。

B2、BRET與FRET相比的優勢

熒光共振能量轉移（FRET），生物發光供體被第二種熒光素所替代，其發射光譜與受體熒光素的激發光譜重疊。與FRET相比，BRET的主要優勢在于：沒有光淬滅或供體蛋白的光異構化，對細胞無光損傷，無光散射，或細胞或酶標板的自發熒光。因沒有受體直接激發引起的光發射，BRET背景更低，允許檢測更低濃度蛋白間的相互作用。

C、報告基因檢測（Rluc as a reporter gene）

海腎熒光素酶（Rluc）用作報告基因以研究體內外的基因調控和功能，普遍用于多重轉錄報告基因檢測或用作熒光蟲熒光素酶轉染的內參。

工作原理如下：海腎熒光素酶（RLuc），分子量為36kDa的單體蛋白，在氧氣的作用下氧化腔腸素生成熒光（見圖2）。Rluc不需要通過后期的翻譯加工來獲得活性，只需要翻譯后就能用作基因報告子。

圖2. 海腎熒光素酶（Rluc）催腔腸素發光的反應流程。

我司提供天然腔腸素以及幾種腔腸素衍生物，它們對鈣離子的親和力，光譜特性，以及應用傾向上會有差異，詳見表1—天然腔腸素及其衍生物的光譜特性，表2—天然腔腸素及其衍生物的應用差異選擇適當的產品。

表1 天然腔腸素及其衍生物的光譜特性：

表2天然腔腸素及其衍生物的應用差異：

腔腸素系列產品重要事項：

1. 腔腸素凍干粉需-20℃避光保存，且保存在惰性氣體下。

2. 溶于甲醇或乙醇，不可溶于DMSO。

3. 腔腸素儲存液不建議保存在-20℃或-70℃。因腔腸素是一種高能量的雙雜環丁酮環狀結構，即使在低溫下也會自發降解。

綜合以上的特征，我司提供所有凍干粉產品都含惰性氣體保證其穩定性。且多以小包裝（50μg或500μg）的形式提供，以減少因單次使用不完造成的資源浪費。

體內注射用腔腸素產品：

我司特別提供專門用于體內動物實驗研究用的注射用腔腸素產品。粉末不僅純度非常高，且提供特別溶劑以增強粉末的溶解能力。

應用示例【生物化學發光體內成像】

Fig. In vivo visualization of mitochondrial Ca2+uptake in the hindlimb muscle after stimulation of the sciatic nerve. (A) Direct visualization of Ca2+-induced bioluminescence in the hindlimb muscle after tetanic stimulation of the sciatic nerve (5 ms pulses at 50 Hz for 2.5 s). Each frame represents 1 s of light accumulation superimposed with the video image taken before the acquisition of bioluminescence. The FOV was 16×12 cm. Smoothing has been applied to the bioluminescent image overlay to a resolution of 1 mm. Color scale is in photons/pixel/s. (B) Mice were injected (i.v) with native coelenterazine (4 mg/kg) and Ca2+-induced light emission was recorded immediately after in the hindlimb muscles in response to tetanic stimulations applied every 2 minutes over more than 1.5 hours. The plot shows the increasing amplitude of the light response (photons/s) as a function of time.

注意事項：

1.      所有產品僅供科研用途，不可用做臨床或診斷用途。

2.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。