BCA Protein Assay Kit

產品介紹

BCA（Bicinchoninic acid）法是目前世界上最常用的兩種蛋白濃度檢測方法之一。BCA蛋白質定量包括兩步反應：首先，二價銅離子(Cu2+)在堿性條件下被蛋白質的肽鍵還原成一價銅離子(Cu+)；其次，兩個分子的 BCA絡合一個一價銅離子(Cu+)，形成一種在 562 nm處有強吸 收值的紫色復合物，而復合物的吸收值與蛋白的濃度在一定范圍內呈線性相關（如圖）。

使用 BCA法進行蛋白質定量有以下特點： 

1 不受蛋白種類的影響，在 20-2000 μg/mL濃度范圍內有較好的線性。

2 表面活性劑對濃度檢測的干擾較小。但由于還原劑和螯合劑對反應有阻礙，因此本制品不適用于含有還原劑或者螯合劑的蛋白質樣品的定量。

表1是試劑盒的基本組成，我們提供兩種檢測方案：試管和微孔板。試管方案所需樣品量較大(0.1 mL),但樣品和工作液的稀釋比例為1:20（V/V），所以干擾物的影響比較小；微孔板方案所需的工作液較少(200 μL)，樣品體積少(25 μL)，但樣品和工作液的稀釋比例為 1:8(V/V)， 對干擾物的耐受較差。

表 1. BCA Protein Assay Kit組成

操作步驟

1 BSA標準品稀釋梯度

按照表 2制備一組蛋白質標準品。最好使用與待測樣品相同的稀釋液，每個稀釋濃度的標準品的體積足夠用于三次重復檢測。

表2.稀釋牛血清蛋白（BSA）標準品

2 制備 BCA工作液

1) 使用下述公式來確定所需的工作液的總體積:（標準品的個數+待測蛋白質樣品的個數）×（實驗重復次數）×（用于每個樣品的工作液的體積）=所需工作液總體積

2) 將 50份 Solution A與1份 Solution B混合（A:B=50:1），制備工作液。

3 試管方案（樣品與工作液的比例=1:20）

1) 取各個稀釋濃度的蛋白質標準品和待測蛋白質樣品各 0.1 mL，加入到做好標記的試管中。

2) 在每個試管中加入 2.0 mL工作液，充分混合。

3) 將試管密封，根據不同實驗方案，選擇相應的溫度和時間進行孵育：

標準方案：37℃，30 min

增強方案：60℃，30 min

4) 將所有試管冷卻至室溫。

5) 將分光光度計波長設定在 562 nm，用 I管空白標準品對儀器進行調零（增強方案用 F管空白標準品對儀器進行調零），然后在 10 min內依次檢測所有樣品的吸光值。

6) 將 BSA標準品在 562 nm處經過空白校正的吸光值對其濃度（μg/mL）作圖，繪制標準曲線。使用該標準曲線來確定每個待測蛋白質樣 品的濃度。

4 微孔板方案（樣品與工作液比例=1:8）

1) 取各個稀釋濃度的蛋白質標準品和待測蛋白質樣品各 25 μL，加入到微孔板中。

2) 在每一個孔中加入200 μL工作液，并在震蕩器上震蕩 30 s，使其充分混合。

3) 將微孔板密封，在 37℃孵育 30 min。

4) 將微孔板冷卻至室溫，使用酶標儀測量樣品在 562 nm處的吸光值。

5) 將各個標準品和待測蛋白質樣品在 562 nm處的吸光值減去空白標準品在 562 nm處的平均吸光值。

6) 將 BSA標準品在 562 nm處經過空白校正的平均吸光值對其濃度（μg/mL）作圖，繪制標準曲線。使用該標準曲線來確定每個待測蛋白 質樣品的濃度。

5 注意事項

1) 當 Solution B加入到 Solution A中時，開始可觀察到有渾濁產生，攪拌后渾濁迅速消失，得到果綠色的澄清工作液。根據所要檢測的樣 品數量，配制足夠體積的工作液。配制好的工作液在室溫密閉容器中可穩定保存 24 h。

2) 該方法不是終點法，孵育完成后，工作液和待測樣品混合液仍會繼續顯色，但室溫的顯色速率較慢，請在 10 min內完成所有樣品檢測， 就不會產生明顯誤差。

3) 標準方案檢測時，如實驗條件限制無法進行 37℃孵育，也可選擇室溫孵育 2 h。

4) 延長孵育時間或者升高溫度會使工作液與待測樣品反應顏色變深，在 562 nm處吸收值變高，影響讀數的準確性，降低試劑的檢測靈敏 度。

5) 增強方案操作不建議在微孔板中進行，因微孔板中樣品量較少，加熱過程中易揮發，影響檢測準確度。

6) BCA試劑盒對各試劑的耐受濃度，請咨詢 ACE的技術支持。

7) 不同蛋白用 BCA試劑盒檢測，都會有獨特的吸光度反應。通常使用 BSA作為標準定量未知蛋白的濃度，但如果需要精確定量，請使用高純度目的蛋白做標準品。其他蛋白相對 BSA的吸光度系數，請咨詢 ACE的技術支持。

常見問題及解決方法