化學發光試劑盒

ECL Basic/Enhanced/Super

 產品介紹 

本產品是基于魯米諾底物的化學發光試劑盒，能夠被辣根過氧化物酶（HRP）催化發光。本試劑盒優化了底物組成，使用了新型高效增強劑，發光 強度比傳統ECL顯色液提高了30-100倍，并有效地降低了背景。試劑盒使用新的氧化劑代替不穩定的雙氧水，提高了試劑盒的穩定性，室溫可穩定放置1年。發光檢測工作液被HRP催化后，發出特定波長熒光（400-450 nm），可對X光膠片曝光，也可直接使用熒光CCD掃描，主要應用于 Western檢測以及化學發光免疫檢測系統。

緩沖液配制 

一抗工作濃度： 0.2-1.0 μg/mL； 

HRP標記二抗工作濃度： 10-500 ng/mL，根據二抗效價調整； 

發光檢測工作液的使用比例： Solution I : Solution II = 1:1；10 cm2 轉印膜使用1-2 mL工作液。 

抗體去除液 

ECL Basic： 0.1 M 甘氨酸，HCl調整pH至2.7； 

ECL Enhanced： 2% SDS, 0.1 M β-mercaptoethanol, 50 mM Tris-HCl, pH 7.0； 

ECL Super： 6 M GuHCl, 0.2% Nonidet P-40 (NP-40), 0.1 M β-mercaptoethanol, 20 mM Tris-HCl, pH7.5。

操作步驟 

根據常規操作轉印結束后，進行封閉、一抗孵育、二抗孵育以及必要的洗膜步驟，根據膜的大小，按每10 cm2 膜使用1-2 mL工作液，按比例吸取 等體積Solution I和Solution II混勻，配制成發光檢測工作液。用平頭鑷子將膜取出，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，去除膜上多余的液體。用移液器 將工作液加到轉印膜上，使其均勻覆蓋，室溫孵育1-2 min，此步驟可在潔凈保鮮膜上或塑料盒中完成。 

1 X光膠片法 

1) 用平頭鑷子夾起轉印膜，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，去除膜上多余的液體，留下少量工作液，不要讓膜完全干燥。膜的蛋白面朝上，包裹于潔 凈保鮮膜內。輕輕趕出其間的氣泡，用小塊透明膠帶粘住四角，固定在X光片暗盒內。 

2) 在暗室中取一張X光膠片置于包裹的膜上，合上暗盒，曝光30 s至1 min。立即定影、顯影，根據曝光強度，調整下一張X光膠片的曝光時間。如 果背景過高，可以使用兩張X光膠片同時壓片。 

2 熒光拍照法 

1) 如果需要使用CCD拍照，可以將膜放置于工作液中，開機后按照使用說明，將轉印膜取出，進行拍照。 

2) 可以根據背景情況，調整機器測量參數，提高信噪比。

3 管式化學發光法 

1) 將魯米諾的化學發光檢測波長可設定在425 nm左右，可以選擇單點測量，或者取多次平均值。 

2) 按照機器要求，將配制好的工作液加入到樣品管中，間隔一定時間測量發光強度，注意魯米諾系統的發光到達峰值有一定延遲（30-300 s），不同樣本的測量時間間隔要固定。 

3) HRP催化魯米諾發光的體系還受到反應溫度以及pH的強烈影響，所以工作試劑準備以及發光測量需要考慮到此類因素。

問題及解決方案

性能展示

注意事項 

1）試劑盒Solution I為底物，保存于避光試劑瓶中，Solution II為氧化劑。通常取樣順序是先取底物Solution I, 換槍頭后再取氧化劑Solution II。 

2）本試劑盒較為穩定，室溫（25℃）可以保存一年以上，長期不用建議保存在2-8℃。 

3）使用生物素-親和素系統時，避免使用牛奶封閉，可能會造成背景過高。 

4）金屬氧化物顆粒可能會造成膜上出現顆粒狀斑點，避免使用帶有銹跡的剪刀以及鑷子，可以使用平頭塑料鑷子。 

5）疊氮化鈉抑制HRP的催化能力，在緩沖液中盡量避免使用疊氮化鈉作為防腐劑。 

6）封閉、洗膜、孵育等步驟耗時較長，注意膜與塑料界面的摩擦不均勻可能造成部分位置條帶消失，可以在保鮮膜中孵育以及封閉，洗膜的塑料 盒底面不要有明顯凸起，可以通過剪角的方法，區別轉印膜有蛋白的一面。 

7）不同轉印膜對蛋白的吸附能力不同，硝酸纖維素較軟，避免出現折痕。PVDF膜使用前需要使用甲醇水化均勻。 

8）勿將多張膜置于同一個洗膜盒中洗膜，相互吸附以及摩擦可能造成很深的背景。 

9）轉印、封閉、孵育都要避免氣泡。