無縫克隆試劑盒

DNA Assembly Cloning Kit 

產(chǎn)品介紹 

DNA Assembly Cloning Kit 是一種簡單、快速并且高效的DNA無縫克隆試劑盒，可將插入片段定向克隆至任意載體的任意位點(diǎn)。使用任意方式 將載體進(jìn)行線性化，在插入片段正/反向PCR引物5’端引入線性化載體的末端序列，使得PCR產(chǎn)物5’和3’最末端分別帶有和線性化載體兩末 端一致的序列(25-40 bp)。這種兩端帶有載體末端序列的PCR產(chǎn)物和線性化載體按一定比例混合后，在重組酶的催化下，50℃反應(yīng)15 min即 可進(jìn)行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆。

產(chǎn)品組分：

適用范圍

- 快速克隆 

- 高通量克隆 

- 無縫克隆 

- 定點(diǎn)突變 

自備材料： 

- DNA片段； 

- 線性化載體； 

- 感受態(tài)細(xì)胞：克隆菌株制備的化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞； 

DH5α Competent E.coli Strain常規(guī)克隆，適用于＜15 kb質(zhì)粒； 

XL10 Competent E.coli Strain大片段克隆，適用于＞10 kb質(zhì)粒； 

- 其他材料：ddH2O、PCR管、PCR儀等；

產(chǎn)品優(yōu)勢

1.將一個(gè)或多個(gè)插入片段定向克隆至任意載體的任意位點(diǎn)

2.陽性克隆比例高，陽性克隆率在90%以上

3.反應(yīng)迅速，在50°C反應(yīng)條件下，15min即可完成重組反應(yīng)

4.顛覆傳統(tǒng)克隆，無需酶切，一管式MIX，操作簡單

保存條件

-20 ℃可以長時(shí)間存放,避免反復(fù)凍融。

操作步驟

１.在冰上配置以下反應(yīng)體系：

             注：* 陽性對照含載體和2個(gè) DNA 片段。 

                      * 每個(gè)克隆反應(yīng)體系中，線性化載體和單個(gè) DNA 片段推薦使用量各為0.1 pmol。 

                      * 若您使用未純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行重組反應(yīng)，未純化的DNA片段的體積不能超過總反應(yīng)體積的10%。

??2. 用移液槍輕柔地混勻反應(yīng)物。 

3. 將反應(yīng)管置于PCR儀中50°C孵育15 min(>6個(gè)片段的拼接,時(shí)間延長為30 min)。 

4. 吸取2 μL 的反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。推薦使用高效感受態(tài)細(xì)胞，即每1 μg pUC19 載體轉(zhuǎn)化后至少能得到>2×108 轉(zhuǎn)化子。 

5. 若需要進(jìn)行電轉(zhuǎn)，將反應(yīng)液稀釋5倍，再吸取1 μL 進(jìn)行轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。 

6. 取1/10 體積的轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行涂布，若您克隆多于3個(gè)目的片段，建議您對轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)離心后再涂布。對于陽性對照反應(yīng)，取1/10體積 的轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在含0.1 mM IPTG 的氨芐培養(yǎng)板上。 

7. 37°C 過夜培養(yǎng)。??

DNA片段加入量計(jì)算

1. 每個(gè)反應(yīng)中單個(gè)DNA片段的推薦使用量為0.1 pmol。 

2. 推薦DNA片段和載體的摩爾比為1:1。 

3. 當(dāng)克隆片段小于200 bp時(shí)，推薦DNA片段和載體的摩爾比為5:1。 

4. 使用UV或熒光檢測目的DNA片段的濃度，參考下列公式計(jì)算反應(yīng)中每個(gè)DNA片段的用量。

μl of DNA fragment=

ng/μl0.65×pmol×bp

或者您還可以參考下面的表格，根據(jù)片段的長度來粗略估計(jì)相應(yīng)的每個(gè)反應(yīng)中DNA片段的用量(例如: 每個(gè)反應(yīng)中加入0.1 pmol的DNA 片段):