Magneti-Q Anti-DYKDDDDK（FLAG）Beads

產(chǎn)品介紹

1 DYKDDDDK標(biāo)簽 

DYKDDDDK 肽段是融合蛋白表達(dá)純化過程中最常用的標(biāo)簽（tag）之一。它可以連接在融合蛋白的N端、C端或序列中間，具有極好的親水性，更容易展示在融合蛋白的表面，干擾融合蛋白功能的可能性較小。另外這一標(biāo)簽具有的優(yōu)勢是連接在目的蛋白的N端時(shí)，可以被 Enterokinase (EK protease)從序列 C 端賴氨酸的位置切除，而不留下冗余殘基。 

2 Anti-DYKDDDDK 抗體 

DYKDDDDK 肽段也經(jīng)常被稱為Flag 肽段, 是蛋白研究領(lǐng)域經(jīng)典的表位標(biāo)簽之一，廣泛用于免疫雜交、免疫沉淀、親和純化等方向。本公司目前有兩株Anti-DYKDDDDK抗體，均有較高的親和力，能夠同時(shí)識(shí)別N端和C端的DYKDDDDK標(biāo)簽，適合做WB、IP、IHC 等免疫相關(guān)實(shí)驗(yàn)。 

3 磁珠性質(zhì) 

Magneti-Q Anti-DYKDDDDK Beads是將高濃度的DYKDDDDK抗體偶聯(lián)至瓊脂糖磁珠上，可直接用于DYKDDDDK融合蛋白的純化。磁珠性能見表1。 

表1.Magneti-Q Anti-DYKDDDDK Beads產(chǎn)品性能

使用方法

1 緩沖液準(zhǔn)備 

所用水和緩沖液在使用之前建議用0.22μm或0.45μm濾膜過濾。 平衡/洗雜液：PBST（1×PBS+0.02%Tween-20，pH7.4） 酸性洗脫液：0.1Mglycine HCl，pH3.0 競爭性洗脫液：50mMTris，0.15MNaCl，100-500μgflag多肽/ml，pH7.4 中和液：1MTris-HCl，pH8.0

2 清洗磁珠 

1）將磁珠充分混勻后取100μl磁珠混懸液置于離心管中放磁力架上靜置，待磁珠完全吸附后，吸棄上清； 

2）加入500ul 平衡液輕輕顛倒混勻3次； 

3）將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸棄上清； 

4）重復(fù)上述操作重復(fù)3次。 

注：可根據(jù)樣本量增加磁珠混懸液的體積（如：1ml樣本加入100ul磁珠混懸液；2ml樣本加入200ul磁珠混懸液）。

3 樣品前處理 

真核表達(dá)的分泌蛋白可直接取培養(yǎng)上清離心。真核或原核表達(dá)的胞內(nèi)蛋白可用裂解液或超聲的方法破碎細(xì)胞后離心取上清，再進(jìn)行后續(xù)步 驟。若樣品中含有核酸雜質(zhì)會(huì)吸附在磁珠上，導(dǎo)致雜蛋白變多。

除去核酸常用兩個(gè)方法： 

1）充分超聲可以打斷核酸，但過度超聲也會(huì)造成蛋白降解； 

2）使用超級(jí)核酸酶消化，這一方法需要注意緩沖液的選擇。低濃度非離子型表面活性劑，如吐溫-20、曲拉通-100可以幫助分散脂類團(tuán)塊， 有助于獲得更純的目的蛋白。

4 樣品孵育 

1）向上述漂洗好的磁珠中加入1ml樣品，2-8℃或常溫下孵育30-60min（建議在旋轉(zhuǎn)混勻儀上孵育，使樣品和磁珠充分接觸）； 

2）孵育結(jié)束后，將離心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，留樣備檢； 

3）向離心管中加入500μl 洗雜液，輕輕顛倒混勻5-10次后將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后棄去上清； 

4）重復(fù)上述清洗操作5次。 

注：蛋白純化需要控制溫度，在2-8℃下孵育有助于防止蛋白降解。操作時(shí)間也至關(guān)重要，有時(shí)候快速進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比加入蛋白酶抑制劑更能 保護(hù)目的蛋白。建議樣品孵育時(shí)間不要超過60分鐘，磁珠每次洗滌，加入洗雜緩沖液后可以冰上靜置3-5分鐘，使雜蛋白從磁珠孔隙中充分溶出。

5 蛋白洗脫 

1）每100-200 μl 磁珠混懸液加入100μl洗脫液，常溫或4℃洗脫5-10min，期間輕輕混勻3-5次； 

2）孵育結(jié)束后將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸取上清至新的離心管中，重復(fù)洗脫三次。洗脫蛋白需要分管收集，分別電泳 確定純度。

6 蛋白洗脫液的選擇 

1）酸性洗脫：一般為pH=2.5-3.0的甘氨酸或者檸檬酸，酸洗脫可有效打開抗體與標(biāo)簽之間的相互作用，但由于大部分蛋白僅能耐受pH5.5 以上的條件，酸洗脫對保持標(biāo)簽蛋白的活性有害，如果不確定融合蛋白可以耐受酸性緩沖液可以進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，洗脫后的蛋白加入1-2M Tris(pH=8.0-8.5)快速調(diào)節(jié)pH恢復(fù)中性； 

2）多肽競爭洗脫：多肽洗脫可以獲得高活力的蛋白，但多肽競爭洗脫的效率較低，磁珠上會(huì)有目的蛋白的殘留。

注意事項(xiàng) 

1）本產(chǎn)品保存在2-8℃冰箱中，不可凍結(jié)保存； 

2）本產(chǎn)品出現(xiàn)輕微團(tuán)聚屬正常現(xiàn)象，可正常使用； 

3）本產(chǎn)品不要使用含有DTT等還原劑的細(xì)胞裂解液樣品，DTT可能會(huì)導(dǎo)致抗體配體的脫落； 

4）本產(chǎn)品能耐受≤2M尿素，高濃度的尿素會(huì)導(dǎo)致抗體配體脫落； 

5）在清洗和洗脫時(shí)避免吸取到磁珠，清洗時(shí)吸取到磁珠會(huì)影響最終的載量，洗脫時(shí)吸取到磁珠會(huì)影響目的蛋白的質(zhì)量和電泳效果，第一次 洗脫后可以將洗脫液置于新的離心管中，再次置于磁力架上進(jìn)行吸附； 

6）本產(chǎn)品不能夠直接高溫加熱磁珠，高溫加熱磁珠將造成抗體大量脫落，后進(jìn)行電泳條帶較多，影響對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷。

參考信息 

1）分泌蛋白純化： 

a. 取2ml培養(yǎng)基上清，高速離心去除顆粒沉淀； 

b. 加入已經(jīng)漂洗過的100ul磁珠懸浮液，混合均勻后放置旋轉(zhuǎn)混勻儀上，室溫孵育1h； 

c. 將含有磁珠的樣品管轉(zhuǎn)移到磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸棄上清； 

d. 用PBST清洗5次后加入不同的洗脫液，每次洗脫孵育10min，重復(fù)洗脫三次； 

e. 對洗脫產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，

常見問題與解答 

1）聚合物磁珠和瓊脂糖磁珠有何區(qū)別？ 

a. 瓊脂糖磁珠是帶孔微球，粒徑在30-100μm，交聯(lián)時(shí)很大一部分配體會(huì)進(jìn)入球孔內(nèi)部，所以偶聯(lián)載量相對較高，非常適用蛋白的快速純 化；而聚合物磁珠通常粒徑為1-3μm以下，配體主要分布在微球表面，這種類型的磁珠能夠快速結(jié)合蛋白，空間位阻影響小，非常適合于 蛋白互作實(shí)驗(yàn)，但其載量不高； 

b. 我們推薦使用瓊脂糖磁珠進(jìn)行蛋白純化實(shí)驗(yàn)；使用聚合物磁珠進(jìn)行蛋白互作實(shí)驗(yàn)如IP、Co-IP和pulldown實(shí)驗(yàn)等。 

2）為何純化不到目的蛋白？ 

a. 可能是由于蛋白表達(dá)量低造成的，建議在純化前用WB或者SDS-PAGE檢測下蛋白原始表達(dá)量，如果WB信號(hào)很弱或者無信號(hào)，目的 蛋白很難純化到； 

b. 可能由于洗脫方式不合適造成，建議根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)窟M(jìn)行洗脫； c. 樣本中有高濃度的還原劑等干擾物質(zhì)，建議用合適的裂解液。