EcoRI, ADCF

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

EcoRI, ADCF 經(jīng)過基因工程重組，能夠在 15 min~1 h 內(nèi)精確完成質(zhì)粒 DNA、PCR 產(chǎn)物或基因組 DNA 等的酶切。

本品的發(fā)酵重組表達(dá)、純化、制劑等各個(gè)環(huán)節(jié)，都不使用包含動(dòng)物來源的成分，也未使用抗生素。

識(shí)別位點(diǎn)：

GAATTC
5'...G ↓ A A T T C...3'
3'...C T T A A ↑ G...5'

同裂酶：FunII

注：同裂酶對(duì)于不同的甲基化修飾也許具有不同敏感性。

注：ADCF(animal derived component free), 不含動(dòng)物源性相關(guān)組分。

產(chǎn)品組成：

保存條件: 

-20℃保存，2年有效。

特性和用法:

? 生產(chǎn)全程無動(dòng)物源性成分

? 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更高，嚴(yán)格控制宿主殘留

? 滿足疫苗生產(chǎn)要求

失活條件：

80℃溫育20 min。

甲基化敏感性：

對(duì)于被 CpG 甲基化的DNA，剪切可能受阻，
對(duì)于被 EcoBI 甲基化的 DNA，剪切可能受阻。

活性定義:

1 活性單位 (U) 是指在 50 μl 反應(yīng)體系中，37℃ 1 h內(nèi)完全酶切 1 μg λDNA 所需的酶量。

蛋白純度檢測(cè):

本品經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)純度 ≥95%。

核酸內(nèi)切酶殘留檢測(cè)：

將20 U酶液與超螺旋質(zhì)粒DNA 在37℃ 溫育4 h，通過 DNA 電泳檢測(cè)質(zhì)粒無變化。

藍(lán)白斑檢測(cè)：

將含有單一lacZα基因的載體以1 μl EcoRI, ADCF消化，重新連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有對(duì)應(yīng)抗生素、IPTG和 X-gal 的 LB培養(yǎng)基平板上。連接正確的產(chǎn)物會(huì)生長(zhǎng)出藍(lán)色菌落，而連接錯(cuò)誤（即DNA末端切口不完整）的產(chǎn)物將得到白色菌落。對(duì)于 ADCF系列限制酶而言，白色菌落比例應(yīng)小于1%。

DNase 殘留檢測(cè)：

將20 U酶液與雙鏈 DNA 底物在37℃ 溫育16 h，通過 DNA電 泳檢測(cè)雙鏈DNA底物無變化。

RNase 殘留檢測(cè)：

將20 U酶液與RNA在37℃ 溫育1 h，通過電泳檢測(cè)RNA無降解。

酶切 - 連接 - 再酶切檢測(cè)：

最適反應(yīng)溫度下，將20 U酶液消化底物，回收酶切產(chǎn)物，在 22℃下使用適量 T4 DNA Ligase (Fast) 可以將酶切產(chǎn)物重新連接, 將連接產(chǎn)物再次回收后，使用相同的內(nèi)切酶可以重新切開連接產(chǎn)物。

宿主DNA殘留檢測(cè)：

將酶液中殘留的核酸經(jīng)E.coli 16S rDNA特異性的TaqMan qPCR檢測(cè)，E.coli 基因組殘留低于 10 pg。

宿主蛋白殘留檢測(cè)：

本品經(jīng)ELISA法檢測(cè)E.coli宿主蛋白含量≤ 50 ppm。

微生物限度檢測(cè)：

本品經(jīng)微生物計(jì)數(shù)法檢測(cè)，需氧菌總數(shù)≤5 cfu/ml，霉菌和酵母菌 總數(shù)≤5 cfu/ml。

細(xì)菌內(nèi)毒素殘留檢測(cè)：

本品細(xì)菌內(nèi)毒素殘留＜0.5EU/KU

使用方法：

① 在冰上按如下建議的加樣順序配制反應(yīng)體系：

a. DNA 底物中應(yīng)不含苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、洗滌劑或高濃度鹽，否則將會(huì)影響EcoRI, ADCF 酶活性；甲基化的 DNA 會(huì)抑制某些限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)。

② 輕柔吸打或輕彈管壁以混勻（切勿渦旋），然后瞬時(shí)離心以收集掛壁液滴；

③ 37℃溫育15 min~1 h，一般推薦5 U~10 U酶/μg DNA、10 U~20 U酶/μg基因組DNA，溫浴1 h，如需過夜酶切反應(yīng)，請(qǐng)將酶量調(diào)整至 1U；

④ 80℃溫育20 min即可使酶失活，停止反應(yīng)，或者通過吸附柱或苯酚/氯仿純化終止反應(yīng)； ⑤ 反應(yīng)體系中加入的酶體積不應(yīng)超過總體積的10%，避免酶中過多的甘油引起星號(hào)活性;

⑥ 限制性內(nèi)切酶存儲(chǔ)緩沖液中的添加劑(例如甘油、鹽)與底物溶液中的污染物(例如鹽、EDTA 或乙醇等)相同，反應(yīng)體積越小，酶切反應(yīng)抑制效應(yīng)越強(qiáng)；

⑦ 小體系推薦加樣體系：

b. 為避免蒸發(fā)，10 μl反應(yīng)體系的孵育時(shí)間不應(yīng)超過1 h。

不同DNA中的酶切位點(diǎn)數(shù)量

甲基化修飾影響

注意事項(xiàng)：

1.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。