Human IFN-γ ELISA kit

檢測原理:

ELISA試劑盒采用雙抗體夾心法：抗人IFN-γ單抗包被于酶標板上，標本和標準品中的人IFN-γ會與單抗結合，游離的成分被洗去。加入生物素化的抗人IFN-γ抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素，生物素與親和素特異性結合；抗人IFN-γ抗體與結合在單抗上的人IFN-γ結合而形成免疫復合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物，若反應孔中有人IFN-γ，辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑現藍色，加終止液變黃。在450 nm處測OD值，人IFN-γ濃度與OD450值之間呈正比，可通過繪制標準曲線求出標本中人IFN-γ的濃度。

人 IFN-γ簡介：

人IFN-γ為21-24KDa的亞基構成的同二聚體，與IFN-α,β不同，IFN-γ的合成只能在T細胞和NK細胞。它可增加單核細胞的吞噬和吞飲作用，刺激細胞通過釋放氧化因子和TNF-a 而殺滅腫瘤細胞，它可增加激活B細胞的繁殖，與IL-2協同增加免疫球蛋白輕鏈的合成。此外IFN-γ激活中性粒細胞，NK細胞，血管內皮細胞，在許多病理情況下，IFN-γ作為疾病的標志物的作用已得到證實。病毒感染時，IFN-γ產生。IFN-γ可作為鑒別結核性與非結核性腹水的診斷工具。IFN-γ在結核性腹水中的濃度顯著高于非結核性腹水,靈敏度和特異性均達到100％。IFN-γ對多發性硬化癥的免疫治療的設計及檢測有重要意義。在移植物排斥反應臨床癥狀出現前，IFN-γ的表達量增加，I型糖尿病的初期，IFN-γ的產生顯著下降。

保存條件: 

試劑盒組成：

試驗所需自備試驗器材 (不提供，但可協助購買) :

1.      酶標儀(450 nm波長濾光片)

2.      進口品牌高精度加液器及一次性吸頭：0.5-10 μL, 2-20 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL。

3.      37 ℃恒溫箱, 雙蒸水或去離子水，坐標紙等。

可協助代購相關產品，請咨詢。

標本收集:

1.      收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內毒素試管。

2.      血漿抗凝劑推薦使用EDTA。避免使用溶血，高血脂標本。

3.      標本應清澈透明，懸浮物應離心去除。

4.      標本收集后若不及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20 ℃，-70 ℃電冰箱內，避免反復凍融，3-6月內檢測。

5.      如果您的樣本中檢測物濃度高于標準品最高值，請根據實際情況，做適當倍數稀釋(建議做預實驗，以確定稀釋倍數)。

注意事項:

1.      試劑盒使用前請保存在2-8 ℃。復溶后的標準品若未用完，請廢棄。

2.      濃縮生物素化抗體，濃縮酶結合物體積小，運輸中顛簸和可能的倒置，會使液體沾到管壁或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或1000轉/分離心1分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。

3.      從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶,屬于正常現象，微加熱至40℃使結晶完全溶解后再配制洗滌液。（加熱溫度不要超過50 ℃）使用時洗滌液應為室溫。

4.      不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應終止液除外）。

請提前咨詢上海諾寧生物科技有限公司。

5.      充分輕微混勻對反應結果尤為重要，最好使用微量振蕩器(使用最低頻率)，如無微量振蕩器，可在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。

6.      在試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙孔檢測。

7.     試驗中所用的試管和吸頭均為一次性使用，嚴禁在不同的液體之間混用！否則將影響試驗結果。

8.      試驗中請穿著試驗服并帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液標本時，請按國家生物試驗室安全防護條列執行。

9.     如果分次使用，請根據需要量配制各組分，以免配制過多造成浪費而影響后續試驗。剩余板孔請用封板膠紙封住，放回鋁箔袋中,2個月內用完。

檢測前準備工作:

1.      請提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫。

2.      用雙蒸水將20×濃縮洗滌液稀釋成1×工作液。未用完的放回4 ℃。

3.      標準品: 加入標準品&標本通用稀釋液0.8 ml至凍干標準品中，靜置15分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為2000 pg/ml)。然后根據需要進行稀釋。(建議標準曲線使用以下濃度：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml)。0 pg/ml即空白孔。復溶標準品原液(2000 pg/ml）若未用完的請廢棄。

4.      生物素化抗體工作液：按當次試驗所需要的用量，使用前20分鐘，用生物素化抗體稀釋液將30×濃縮生物素化抗體稀釋成1×工作液。當日使用。若實驗次數過多導致生物素化抗體量不足，可向上海諾寧生物公司單獨購買生物素化抗體。（須提供抗體批號）

5.      酶結合物工作液：按當次試驗所需要的用量，使用前20分鐘，用酶結合物稀釋液將30×濃縮酶結合物稀釋成1×工作液。當日使用。若實驗次數過多導致濃縮酶結合物量不足，可上海諾寧生物公司單獨購買濃縮酶結合物。（須提供酶結合物批號）

標準品稀釋方法圖例：

以500 μL/管為例，用標準品&標本通用稀釋液將復溶后的標準品母液進行倍比稀釋，具體稀釋方法如下圖，也可根據實際用量來稀釋，如200 μL/管。

洗滌方法:

1.      自動洗板機：要求注入的洗滌液為350 μL，注入與吸出間隔30－60秒。洗板5次。

2.      手工洗板：甩盡孔內液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350 μL，靜置30秒后甩盡液體，在厚迭吸水紙上拍干。洗板5次。

操作步驟:

1.      從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和干燥劑請放回鋁箔袋內壓實自封條，密封口袋，放回4 ℃。

2.      空白孔加標準品&標本通用稀釋液，其余相應孔中加標本或不同濃度標準品(100 μL/孔)，用封板膠紙封住反應孔，37 ℃恒溫箱，避光孵育90分鐘。

3.      提前20分鐘準備生物素化抗體工作液。

4.      洗板5次。

5.      空白孔加生物素化抗體稀釋液，其余孔加入生物素化抗體工作液(100 μL/孔)。用新封板膠紙封住反應孔，37 ℃恒溫箱，避光孵育60分鐘。

6.      提前20分鐘準備酶結合物工作液。避光室溫(22-25 ℃)放置。

7.      洗板5次。

8.      空白孔加酶結合物稀釋液，其余孔加入酶結合物工作液(100 μL/孔)。用新封板膠紙封住反應孔，37 ℃恒溫箱，避光孵育15分鐘。

9.      打開酶標儀電源，預熱儀器，設置好檢測程序。

10.  洗板5次。

11.  加入顯色底物(TMB)100 μL/孔，37 ℃恒溫箱，避光孵育15分鐘。

12.  加入反應終止液100 μL/孔, 混勻后即刻測量OD 值(3分鐘內) 450 。在儀器保存讀數結果并打印一份紙質結果。

13.  實驗完畢后將未用完的試劑按規定的保存溫度放回電冰箱保存至有效期結束。

建議保存酶標板框，以備下次或者今后試驗使用。

結果判斷:

1.      每個標準品和標本的OD值應減去空白孔的OD值。

2.      以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，手工繪制或用軟件繪制并選取最佳擬合曲線，推薦使用二次多項式方程擬合。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

3.     若標本OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數。

注意：本圖僅供參考，應以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本中人IFN-γ的含量。

靈敏度、特異性和重復性:

● 靈敏度：最小可測人IFN-γ達7.8pg/ml(8次獨立重復實驗平均值)。

● 特異性：本試劑盒特異性識別天然和重組人IFN-γ。與以下細胞因子等無明顯交叉反應。

● 重復性：板內，板間變異系數均<10%。

ELISA 常見問題分析：

問題一：高背景或陰性對照值偏高

問題二：陽性對照值偏低或低吸光度

問題三：邊緣效應

問題四：標準曲線不佳

問題五：標準曲線良好，但樣本無檢測信號

問題六：重復性較差

注意事項：

1.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

本產品僅用于生命科學研究，不得用于醫學診斷及其他用途！