pH熒光探針（綠500-PEG12 馬來(lái)酰亞胺）

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

pH Green 500-PEG12 馬來(lái)酰亞胺是一種硫醇反應(yīng)型pH敏感熒光標(biāo)記物，專(zhuān)為開(kāi)發(fā)可響應(yīng)pH變化的生物偶聯(lián)探針而設(shè)計(jì)，用于實(shí)時(shí)研究活細(xì)胞中的抗體內(nèi)化、內(nèi)吞作用及吞噬作用等生物學(xué)過(guò)程。該染料通過(guò)引入十二聚乙二醇（PEG12）分子間隔臂，顯著提高了水溶性，在確保生物功能完整性的同時(shí)有效避免了生物偶聯(lián)物的聚集問(wèn)題。

該染料的熒光特性呈現(xiàn)獨(dú)特的pH依賴(lài)性：當(dāng)環(huán)境pH從堿性向酸性轉(zhuǎn)變時(shí)，其熒光強(qiáng)度隨之增強(qiáng)，這一變化與細(xì)胞內(nèi)囊泡的酸化進(jìn)程高度吻合。由于其在常規(guī)細(xì)胞外環(huán)境中基本不產(chǎn)生熒光信號(hào)，這一特性使得實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可大幅減少洗滌步驟。該探針特別適用于吞噬體、內(nèi)體和溶酶體等酸性細(xì)胞區(qū)室的監(jiān)測(cè)，在這些酸性微環(huán)境中會(huì)表現(xiàn)出顯著的熒光增強(qiáng)效應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)酸性位點(diǎn)的精準(zhǔn)檢測(cè)。

這種特性使得該染料在成像分析、流式細(xì)胞術(shù)和高內(nèi)涵篩選（HCS）等應(yīng)用中，能夠以更低的信號(hào)變異度和更高的檢測(cè)準(zhǔn)確性實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞酸性區(qū)室的特異性檢測(cè)。其馬來(lái)酰亞胺官能團(tuán)可選擇性地與蛋白質(zhì)或肽段中的還原型半胱氨酸巰基、硫代磷酸化寡核苷酸以及小分子配體進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)。所制備的生物偶聯(lián)物不僅為吞噬作用和內(nèi)吞作用等細(xì)胞過(guò)程的靶向檢測(cè)分析提供關(guān)鍵工具，更能支持細(xì)胞功能的綜合多重分析，為深入探究細(xì)胞動(dòng)態(tài)學(xué)過(guò)程提供強(qiáng)有力的研究手段。

產(chǎn)品特性：

1)     分子量：1164.32

2)     溶解度：在DMSO中溶解

3)     Ex(nm)：453

4)     Em(nm)：522

pH熒光探針（綠500-PEG12 馬來(lái)酰亞胺）的pH依賴(lài)性發(fā)射光譜

保存條件: 

-20℃避光保存，2年有效。

產(chǎn)品使用：（僅供參考）

一、儲(chǔ)備溶液配制

所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成一次性等份，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

1. 蛋白質(zhì)儲(chǔ)備液（溶液A）

將100 μL 反應(yīng)緩沖液（例如，pH ~9.0 的1 M碳酸鈉溶液或1 M磷酸鹽緩沖液）與 900 μL目標(biāo)蛋白溶液（例如，抗體、蛋白濃度> 2 mg/mL（如果可能））混合，得到1 mL蛋白質(zhì)標(biāo)記儲(chǔ)備溶液。

注意：

a)     蛋白質(zhì)溶液（溶液 A）的 pH 應(yīng)為 8.5 ± 0.5。如果蛋白質(zhì)溶液的pH值低于8.0，請(qǐng)使用1 M碳酸氫鈉溶液或 1 M pH 9.0 磷酸鹽緩沖液將 pH 值調(diào)節(jié)至8.0-9.0 范圍。

b)     蛋白質(zhì)應(yīng)溶解在1X 磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)（pH 7.2-7.4）中。如果蛋白質(zhì)溶解在Tris 或甘氨酸緩沖液中，則必須用 1X PBS（pH 7.2-7.4）進(jìn)行透析，去除用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和醋酸銨）。

c)      不純的抗體或用牛血清白蛋白 (BSA) 或明膠穩(wěn)定的抗體標(biāo)記效果不好。疊氮化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應(yīng)。疊氮化鈉或硫柳汞可通過(guò)透析或旋轉(zhuǎn)柱去除，以獲得最佳標(biāo)記結(jié)果。

d)     如果蛋白質(zhì)濃度低于 2 mg/mL，結(jié)合效率會(huì)降低。為了獲得最佳標(biāo)記效率，建議最終蛋白質(zhì)濃度范圍為 2-10 mg/mL。

二、可選：二硫化物還原

如果您的蛋白質(zhì)不含游離半胱氨酸，則必須用DTT或TCEP處理蛋白質(zhì)以生成硫醇基團(tuán)。 DTT 或TCEP將二硫鍵轉(zhuǎn)化為兩個(gè)游離硫醇基團(tuán)。如果您使用 DTT，則必須在將 pH Green 500-PEG12 馬來(lái)酰亞胺與蛋白質(zhì)綴合之前通過(guò)透析或凝膠過(guò)濾去除游離 DTT。

三、以下是生成游離硫醇基團(tuán)的示例方案：

1.      在蒸餾水中制備1 M DTT (15.4 mg/100 μL) 的新鮮溶液。

2.      要在 20 mM DTT中制備 IgG 溶液，請(qǐng)每1 mL IgG 溶液添加20 μL DTT溶液，同時(shí)充分混合。讓溶液在室溫下靜置 30 分鐘，無(wú)需額外混合，以減少半胱氨酸氧化為胱氨酸。

3.      將還原后的 IgG 通過(guò)已用“交換緩沖液”預(yù)平衡的過(guò)濾柱。從柱中收集 0.25 mL 級(jí)分。

4.      確定蛋白質(zhì)濃度并將大部分 IgG 的級(jí)分合并。這可以通過(guò)分光光度法或比色法來(lái)完成。

5.      建議在此步驟后立即進(jìn)行綴合。更多詳情請(qǐng)參閱實(shí)驗(yàn)方案示例。

注意：

a)     為了獲得最佳結(jié)果，IgG 溶液應(yīng) >4 mg/mL。如果蛋白質(zhì)低于 2 mg/mL，則應(yīng)濃縮。應(yīng)額外包括 10% 的緩沖液交換柱損失。

b)     還原反應(yīng)幾乎可以在 pH 7-7.5 的任何緩沖液中進(jìn)行（例如 MES、磷酸鹽或 TRIS 緩沖液）。

c)      步驟3和4可以用透析代替。

四、pH Green 500-PEG12 馬來(lái)酰亞胺儲(chǔ)備溶液（溶液 B）

將無(wú)水 DMSO 添加到pH Green 500-PEG12 馬來(lái)酰亞胺小瓶中，制成 10 mM 儲(chǔ)備溶液。通過(guò)移液或渦旋充分混合。

注意：在開(kāi)始綴合之前準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液（溶液 B）。及時(shí)使用。延長(zhǎng)儲(chǔ)存染料原液可能會(huì)降低染料活性。溶液 B 在避光、防潮的情況下可在冰箱中保存兩周。避免凍融循環(huán)。

操作步驟

該方案是為將pH Green 500-PEG12 馬來(lái)酰亞胺與山羊抗小鼠 IgG 綴合而開(kāi)發(fā)的。您的特定蛋白質(zhì)可能需要進(jìn)行額外的優(yōu)化。

注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的特性。蛋白質(zhì)的過(guò)度標(biāo)記可能會(huì)對(duì)其結(jié)合親和力產(chǎn)生不利影響，而低染料/蛋白質(zhì)比率的蛋白質(zhì)綴合物會(huì)降低靈敏度。

1. 運(yùn)行綴合反應(yīng)

a)     1.1使用摩爾比為 10:1 的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白質(zhì)）作為起點(diǎn)：將 5 μL 染料儲(chǔ)備溶液（溶液 B，假設(shè)染料儲(chǔ)備溶液為 10 mM）添加到小瓶中有效搖動(dòng)的蛋白質(zhì)溶液（95 μL 溶液 A）。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為 10 mg/mL，蛋白質(zhì)的分子量為 ~200 KD，則蛋白質(zhì)濃度為 ~0.05 mM。

注意：我們建議使用溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白質(zhì)）摩爾比為 10:1 的溶液。如果太低或太高，則分別確定最佳染料/蛋白質(zhì)比例為 5:1、15:1 和 20:1。

b)     1.2繼續(xù)在室溫下旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)反應(yīng)混合物30-60分鐘。

2. 純化

以下方案是使用 Sephadex G-25 柱純化染料-蛋白質(zhì)綴合物的示例。

a)     根據(jù)說(shuō)明準(zhǔn)備 Sephadex G-25 柱。

b)     將反應(yīng)混合物（來(lái)自“進(jìn)行綴合反應(yīng)”）加載到 Sephadex G-25 柱的頂部。

c)      當(dāng)樣品剛好流到頂部樹(shù)脂表面下方時(shí)，立即添加 PBS（pH 7.2-7.4）。

d)     向所需樣品中添加更多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成柱純化。合并含有所需染料-蛋白質(zhì)綴合物（注：柱式純化后的樣品，會(huì)根據(jù)成分不同分出多個(gè)，請(qǐng)檢查出哪些包含了我們需要的熒光素標(biāo)記蛋白產(chǎn)物，將所有包含該目標(biāo)產(chǎn)物的分?jǐn)?shù)給取出來(lái)集中在一起。）。

注意：為了立即使用，染料-蛋白質(zhì)綴合物需要用染色緩沖液稀釋?zhuān)⒌确侄啻问褂谩?/span>

注意：為了長(zhǎng)期保存，染料-蛋白質(zhì)綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥。

 3. 表征所需的染料-蛋白質(zhì)綴合物

取代度 (DOS) 是表征染料標(biāo)記蛋白質(zhì)的最重要因素。較低 DOS 的蛋白質(zhì)通常具有較弱的熒光強(qiáng)度，但較高 DOS（例如 DOS > 6）的蛋白質(zhì)也往往具有減弱的熒光。大多數(shù)抗體的最佳 DOS 建議在 2 到 10 之間，具體取決于染料和蛋白質(zhì)的特性。為了有效標(biāo)記，應(yīng)控制取代度，使 1 摩爾抗體具有 6-8 摩爾pH Green 500-PEG12 馬來(lái)酰亞胺。以下步驟用于確定pH Green 500-PEG12 馬來(lái)酰亞胺標(biāo)記蛋白質(zhì)的DOS。

4. 測(cè)量吸收率

a)     要測(cè)量染料-蛋白質(zhì)綴合物的吸收光譜，建議根據(jù)染料的消光系數(shù)將樣品濃度保持在 1-10 μM 范圍內(nèi)。

b)     在 280 nm 處讀取 OD（吸光度）和染料最大吸光度（對(duì)于pH Green 500-PEG12 馬來(lái)酰亞胺染料，?max = 522 nm）

c)      對(duì)于大多數(shù)分光光度計(jì)，樣品（來(lái)自柱餾分）需要用去離子水稀釋?zhuān)允?span> OD 值在 0.1 至 0.9 范圍內(nèi)。外徑（吸光度）280 nm 是蛋白質(zhì)的最大吸收，而 522 nm是pH Green 500-PEG12 馬來(lái)酰亞胺的最大吸收。為了獲得準(zhǔn)確的DOS，請(qǐng)確保綴合物不含非綴合染料。

注意事項(xiàng)：

1.      熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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