水溶性外泌體熒光標(biāo)記染料（Aco-600，紅色）

Water-soluble Fluorescent Dye for Exosome Labeling (Aco-600, red)

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產(chǎn)品簡介：

Acoerela 的Aco-600 屬于水溶性、跨膜的共軛寡電解質(zhì)（COEs）。這類親脂性染料具備獨(dú)特性能，能夠完全嵌入目標(biāo)膜的脂質(zhì)雙層，從根源上最大程度減少染料從目標(biāo)中“泄漏”的情況發(fā)生。

在熒光特性方面，Aco-600 只有在與目標(biāo)膜結(jié)合時(shí)， 才會(huì)呈現(xiàn)出顯著的熒光增強(qiáng)效果。同時(shí)，Aco-600具有極高的水溶性，溶解在水性緩沖液時(shí)，既不會(huì)形成膠束，也不會(huì)產(chǎn)生納米顆粒。這一特性使其在納米流式分析以及細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中，能夠有效規(guī)避假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性與可靠性。

產(chǎn)品參數(shù)：

溶劑：水性緩沖液（PBS或Opti-MEM）

推薦激光器：488nm或561nm

熒光信號(hào)峰：600nm

保存條件: 

2-8℃避光保存，1年有效。

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品使用：

一、染料工作液制備

1.      取染料管，加入25μL水性緩沖液（推薦使用PBS或Opti-MEM溶解），配置成濃度為 25μM的儲(chǔ)存液；

2.      使用渦旋振蕩器充分振蕩1min 至染料完全溶解；

3.      40°C水浴15min（如有超聲設(shè)備，可同步開啟超聲輔助溶解）；

4.      取潔凈EP管，對儲(chǔ)存液進(jìn)行分裝；

5.      取適量儲(chǔ)存液，用緩沖液稀釋至10μM的工作濃度。

二、外泌體染色

1.      將純化的細(xì)胞外囊泡(EVs)濃度調(diào)整至10¹¹ Particles/mL；

2.      按表1構(gòu)建染色孵育體系： 表1. Aco-600標(biāo)記外泌體（EV）的樣本制備-10μL體系

3.      加入染料工作液后，蓋緊離心管蓋，用槍頭輕柔吹吸混勻，放置于37℃環(huán)境，避光孵育2小時(shí)。

三、去除游離染料

1.      染色完成后，在樣品中加入2倍體積的PBS，使用100 KDa超濾管*，以3000 ×g的離心力離心 5~10min，進(jìn)行超濾置換，去除溶液中游離的染料，將上室樣品濃縮至原體積；

2.      重復(fù)上述超濾置換步驟 2 次；

*注：完成本次實(shí)驗(yàn)后，請丟棄超濾管，切勿留作下次實(shí)驗(yàn)重復(fù)使用。

3.      收集超濾管上室的樣本，即為染色后的外泌體；

4.      染色后的外泌體建議盡快使用，若在2周內(nèi)使用，可置于 4℃ 環(huán)境中避光保存；如需長期保存，可置于-80℃冷凍保存，保存時(shí)間過長可能影響下游實(shí)驗(yàn)效果。

四、細(xì)胞攝取

1.      提前24小時(shí)鋪種目標(biāo)細(xì)胞；

2.      用不含外泌體的細(xì)胞培養(yǎng)基將染色樣本稀釋5~10 倍，使染色EV濃度調(diào)整為約 5E+09Particles/mL（超濾后外泌體得率約為20%）；

3.      吸除待處理細(xì)胞原有的培養(yǎng)基；

4.      加入含染色EV的新鮮培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱避光孵育24 小時(shí)；

5.      孵育24小時(shí)后，棄去含有染料的孵育液，用PBS 清洗細(xì)胞3次；

6.      根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇成像觀察方式，可直接進(jìn)行活體成像， 也可固定細(xì)胞后成像觀察；

7.      若選擇固定細(xì)胞后成像，使用細(xì)胞固定劑在室溫下固定15 min（固定后觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化，部分固定液滲透壓不穩(wěn)定，可能導(dǎo)致細(xì)胞變形）；

8.      棄去固定劑，用PBS清洗細(xì)胞3次，每次5min；

9.      使用含DAPI的封片劑進(jìn)行封片（或先用DAPI進(jìn)行核染10 min，PBS清洗3次，每次5min，之后進(jìn)行封片）；

10.  共聚焦成像：Aco-600的熒光信號(hào)收集可以使用488、 514、543、559或561nm的激光器，發(fā)射波長從 600 nm開始收集，常用的通道名稱是RFP；

11.  在成像時(shí)順序掃描，避免同時(shí)掃描。先收集Aco-600 的熒光信號(hào)，再收集DAPI信號(hào)（DAPI的激發(fā)器也會(huì)激發(fā)Aco-600）。

五、結(jié)果展示: 

圖1. HEK- 293T細(xì)胞經(jīng)20μg/mL（約10? Particles /mL）的Aco- 600（紅色）染色的PC-3 外泌體（EVs）處理后，孵育24小時(shí)的熒光顯微照片。細(xì)胞核使用 Invitrogen? SYTO? NucleicAcidStain（藍(lán)色）染色。圖像由LeicaThunder 熒光顯微鏡拍攝。

注意事項(xiàng)：

1.      熒光染料均存在淬滅問題，請注意全程避光，以減緩熒光淬滅；

2.      染料工作液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，不能提前配制，否則將影響染色效果；

3.      Aco-600染色固定細(xì)胞時(shí)，樣品宜使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，使用其它不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ簳?huì)導(dǎo)致熒光背景較高；

4.      關(guān)于外泌體染色后去除游離染料：外泌體染色步驟中去除游離染料的步驟必不可少，以避免游離染料對后期實(shí)驗(yàn)的干擾。為保證超濾后有足夠的外泌體回收量，建議用于染料標(biāo)記的外泌體原始濃度達(dá)到 1011 Particles/mL。

5.      染料標(biāo)記外泌體與細(xì)胞共孵育條件：染料標(biāo)記外泌體與細(xì)胞共孵育的培養(yǎng)條件盡可能使用無血清培養(yǎng)基，以提高細(xì)胞對染料標(biāo)記外泌體的攝取效率，共孵育參考時(shí)長為 24 小時(shí)。

6.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

本產(chǎn)品僅用于生命科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷及其他用途！

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