T7 RNA聚合酶（高濃度）

T7 RNA Polymerase (HC) 

產品簡介：

本產品是大腸桿菌重組表達來源的噬菌體T7 RNA聚合酶，是一種依賴DNA的RNA聚合酶，對噬菌體T7啟動子序列具有高度特異性。T7 RNA聚合酶以含有T7啟動子序列的雙鏈DNA為模板，以NTP為底物，合成與啟動子下游的單鏈DNA互補的RNA。

產品組成：

保存條件: 

-20℃保存，2年有效。

活性定義:

1活性單位 (U) 是指在 37℃下，1 h 內使1 nmol ATP摻入酸不 溶物所需要的酶量。

內切酶活性：

37℃下，在20 μl T7 RNA Pol Buffer反應體系中將200 U T7 RNA Polymerase (HC)與200 ng超螺旋質粒DNA共同溫育4 h后，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，少于20%的質粒DNA轉變成缺刻或線性狀態。

DNase活性：

37℃下，在20 μl T7 RNA Pol Buffer反應體系中將200 U T7 RNA Polymerase (HC)與15 ng雙鏈DNA片段共同溫育16 h后，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，雙鏈DNA片段無變化。

RNase活性：

37℃下，在10 μl T7 RNA Pol Buffer反應體系中將200 U T7 RNA Polymerase (HC)與500 ng RNA共同溫育1 h后，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，不低于90%的RNA仍保持完整。

宿主DNA殘留：

采用中國藥典2020版四部通則3407外源性DNA殘留量測定法第三法定量PCR法，本品中大腸桿菌宿主細胞DNA殘留量低于10 拷貝/100 U。

使用方法：

1. 體外轉錄

① 在冰上配制如下反應體系：

a. 建議先加入Nuclease-Free Water, 然后再加入ATP/CTP/GTP/UTP.

b. 可以用同樣摩爾濃度的修飾NTP替代相應的野生型。

② 充分混勻并瞬離后，37℃溫育2 h。若轉錄產物長度＜300 nt，可延長反應時間至3~16 h。

③ 反應結束后，向產物中加入1~2 U DNase I-ST，37℃ 孵育15 min以去除DNA模板。 ④ 獲得的mRNA經純化，質檢合格后用于后續實驗或工藝。

2. 體外共轉錄

① 在冰上配制如下反應體系：

a. 建議先加入Nuclease-Free Water, 然后再加入ATP/CTP/GTP/UTP.

b. 可以用同樣摩爾濃度的修飾NTP替代相應的野生型。

c. 帽子類似物與每種NTP的摩爾濃度之比應為4 : 5 。

② 充分混勻并瞬離后，37℃溫育2~3 h。若轉錄產物長度＜300 nt，可延長反應時間至4~16 h。

③ 反應結束后，向產物中加入1~2 U DNase I-ST，37℃ 孵育15 min以去除DNA模板。 ④ 獲得的mRNA經純化，質檢合格后用于后續實驗或工藝。

注意事項：

1.      不同模板序列的轉錄效率差異較大，初次實驗可先按照建議加入量進行，然后在調整范圍內摸索優化最適體系。

2.      模板DNA可通過線性化環狀質粒或PCR獲得。模板DNA上游需含有T7啟動子序列，下游為平末端或模板鏈5'末端突出。模板 DNA的純度對體外轉錄反應至關重要，而質粒DNA抽提過程中引入的RNase A殘留會顯著影響轉錄RNA的質量，建議使用A260 /A280 為1.8~2.0的高純度RNase-free模板。

3.      酶溶液中均含有甘油，建議體系中各種酶制品添加體積合計不應超過總反應體積的1/5。

4.      共轉錄反應速率一般為普通體外轉錄的1/5~1/2。

5.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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