Poly(A) RNA聚合酶

Poly(A) RNA Polymerase 

產品簡介：

Poly(A) Polymerase是一種來源于大腸桿菌的聚合酶，也稱E.coli PAP、PAP酶、Poly(A)加尾酶或PolyA加尾酶，經大腸桿菌重組表達后純化獲得。Poly(A) Polymerase不依賴于模板，催化ATP轉化為AMP并添加至單鏈RNA的3'端，形成多聚腺苷尾。Poly(A) Polymerase無法以DNA為底物，且不推薦使用雙鏈RNA或過短的寡核苷酸（＜20 nt）為底物。Poly(A) Polymerase催化的Poly(A)加尾反應只能使用ATP，而不能使用ADP或dATP。使用CTP和UTP時，其摻入量不足使用ATP的5%；使用GTP時，完全不能添加到RNA的3'末端。

產品組成：

保存條件: 

-20℃保存，2年有效。

適用范圍：

1. 在 RNA末端添加Poly(A)尾，用于后續克隆或純化。

2. 提升mRNA在真核細胞中的翻譯效率。

3. RNA 的 3' 末端標記。

4. cDNA 合成，為miRNA添加Poly(A)尾后逆轉錄獲得cDNA。

活性定義:

1活性單位(U)是指在20 μl反應體系中，37℃條件下，10 min 催化1 nmol的AMP摻入RNA所需要的酶量。

蛋白純度檢測：

使用SDS-PAGE凝膠電泳檢測，蛋白純度不低于95%。

非特異性內切酶活性：

37℃下，在20 μl反應體系中將5 U Poly(A) Polymerase與 200 ng 超螺旋質粒DNA共同溫育4 h，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，少于 20%的質粒DNA轉變成缺刻或線性狀態。

DNase 活性：

37℃下，在20 μl反應體系中將5 U Poly(A) Polymerase與 15 ng 雙鏈DNA片段共同溫育16 h，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，雙鏈 DNA片段無變化。

RNase 活性：

37℃下，在10 μl反應體系中將5 U Poly(A) Polymerase與 500 ng RNA共同溫育1 h，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，超過90%的RNA 保持完整。

宿主DNA殘留：

采用中國藥典2020版四部通則3407外源性DNA殘留量測定法第三法定量PCR法，本品中大腸桿菌宿主細胞DNA殘留量。

使用方法：

1. 于冰上配制如下反應體系：

a. 為避免雜質影響加尾酶活性，應當使用純化后的RNA；若RNA 3'端存在高級結構，建議對RNA進行預變性(65℃加熱5 min，冰上放置5 min)后再進行加尾，避免影響加尾效果。

2. 37℃孵育30~60 min。加尾長度受酶量、ATP 濃度、反應時間等多個因素影響，可根據實際反應情況進行體系調整。

3. 按照以上反應體系，加Poly(A)尾長度可以超過100個堿基。

4. 加入EDTA至終濃度為10 mM或65℃孵育20 min終止反應。

注意事項：

1.      加尾長度受酶量、ATP濃度和反應時間等因素影響，一般本酶在37℃反應30 min可加約30個A堿基，60 min可加約100個A堿基。

2.      該酶將AMP添加到 RNA 的 3'末端具有較高的選擇性，并不會在所有 RNA 分子中添加相同長度的 Poly (A)。

3.      加尾結束后，在轉染細胞或顯微注射前，必須對RNA進行純化。

4.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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