T7高產(chǎn)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒

T7 High Yield RNA Synthesis Kit 

產(chǎn)品簡介：

T7 High Yield RNA Synthesis Kit 是一種使用 T7 RNA 聚合酶，以帶有 T7 啟動子的 DNA 為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄大量合成RNA的試劑盒,適用于長鏈和短鏈轉(zhuǎn)錄本。本品提供的T7 Enzyme Mix中已經(jīng)預(yù)混了RNase抑制劑與無機(jī)焦磷酸酶，而 DNase l,RNase-free 用于轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后清除模板DNA。使用本品以1 μg 線性化雙鏈 DNA 模板可以轉(zhuǎn)錄獲得至少150 μg以上的 RNA。通過轉(zhuǎn)錄合成的 RNA可用于多種下游應(yīng)用如體外翻譯、RNA結(jié)構(gòu)和功能研究、RNase 保護(hù)、探針雜交、RNA干擾等。

轉(zhuǎn)錄方案：

                                   圖1.非共轉(zhuǎn)錄T7啟動子RNA轉(zhuǎn)錄方案

產(chǎn)品組成：

保存條件: 

-20℃保存，1年有效。

適用范圍：

1. 合成單鏈RNA，包括mRNA，siRNA，gRNA等各類RNA的前體。
2. 合成標(biāo)記或未標(biāo)記的高特異性RNA探針。 
3. 利用帽子類似物合成加帽的mRNA。

使用方法：

1. DNA 模板制備

帶有T7啟動子的線性化質(zhì)粒或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物都可以作為體外轉(zhuǎn)錄模板，模板可以用TE緩沖液或Nuclease-Free Water溶解。

T7啟動子序列：TAATACGACTCACTATAN*

注：N*為 RNA 轉(zhuǎn)錄的第一個堿基,一般為G，若進(jìn)行共轉(zhuǎn)錄由帽子類似物決定。

（1）質(zhì)粒模板

將目的DNA插入含有T7啟動子的質(zhì)粒載體中，然后用限制酶進(jìn)行處理，待完全線性化后進(jìn)行純化。

注1：由于終止子不能保證轉(zhuǎn)錄100%終止，環(huán)狀質(zhì)粒會轉(zhuǎn)錄出不同長度的RNA產(chǎn)物。為了得到特定長度的RNA，質(zhì)粒必須完全線性化。

注2：質(zhì)粒線性化所選限制酶的酶切位點需要緊鄰編碼鏈下游，且在編碼鏈中無識別位點。選擇的限制酶要能形成5'突出末端或者平滑末端。

注3：為了避免蛋白及鹽離子等對轉(zhuǎn)錄體系的影響，線性化質(zhì)粒建議純化后再作為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

注4：質(zhì)粒DNA抽提過程中引入的RNase A殘留會顯著影響轉(zhuǎn)錄RNA的質(zhì)量，建議使用A260/A280為1.8~2.0的高純度RNase-free模板。

（2）PCR產(chǎn)物模板

帶 T7 啟動子的PCR產(chǎn)物可以作為體外轉(zhuǎn)錄模板。首先將T7啟動子序列加在編碼鏈上游引物的5'端，然后在高保真酶的作用下擴(kuò)增含T7 啟動子的DNA模板，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。PCR產(chǎn)物可以不經(jīng)純化直接作為模板，但純化后RNA收率會更高。

注1：PCR產(chǎn)物作為模板，必須電泳確認(rèn)產(chǎn)物的特異性及濃度，建議20 μl反應(yīng)體 系投入2~5 μl PCR產(chǎn)物。

注2：為了得到更多高品質(zhì)的RNA，推薦PCR產(chǎn)物純化之后再作為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

2. 體外轉(zhuǎn)錄

（1）根據(jù)所需產(chǎn)物類型選擇下面三個反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)溶液加樣。

① 標(biāo)準(zhǔn)體外轉(zhuǎn)錄體系

在冰上配制如下反應(yīng)體系：

a. 建議先加入Nuclease-Free Water, 然后再加入 ATP/CTP/GTP/UTP。

b. 可以用同樣摩爾濃度的修飾NTP替代相應(yīng)的未修飾NTP。修飾UTP可參考使用 N1-Methyl-Pseudo-UTP(100mM)和Pseudo-UTP(100mM)。

② 加帽RNA共轉(zhuǎn)錄體系

在冰上配制如下反應(yīng)體系：

c. 帽子類似物與每種 NTP 的摩爾濃度之比應(yīng)為 4 : 5，該摩爾比適用于CleanCap系列帽子類似物。帽子類似物可參考使用 Cap1 analogue AG。 若使用其它結(jié)構(gòu)的帽子類似物，請根據(jù)帽子類似物的說明書設(shè)定帽子類似物與GTP的合理比例，可根據(jù)加帽效率調(diào)整比例，但兩者終濃度之和控制在10 mM 為宜。

③ 非放射性標(biāo)記RNA體外轉(zhuǎn)錄體系

d. 本體系適用生物素修飾UTP、熒光素修飾UTP、地高辛修飾UTP或者氨基烯丙基修飾UTP，使用修飾UTP轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量會比未修飾UTP轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量偏低。

注1：不同模板序列的轉(zhuǎn)錄效率差異較大，初次實驗可先按照建議加入量進(jìn)行，然后再摸索優(yōu)化最適體系，模板量可在 0.5 μg~2 μg 的范圍進(jìn)行調(diào)整。

（2）充分混勻并瞬離后，37℃溫育2 h。若轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度＜100nt，，可延長反應(yīng)時間至3~16 h。

（3）反應(yīng)結(jié)束后，向產(chǎn)物中按照每μg Template DNA加入2 μl DNase I, RNase-free 的比例，37℃孵育15 min以去除 DNA 模板。

（4）轉(zhuǎn)錄后的RNA推薦用磁珠或者柱純化，也可以采用酚/氯仿或者氯化鋰純化。純化后的RNA可以進(jìn)行下游實驗或者儲存于-80℃?zhèn)溆谩?/span>

3. 對照模板轉(zhuǎn)錄（T包裝不含）

對照模板是一個含有T7啟動子的線性DNA片段，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小約4000 nt。在推薦的標(biāo)準(zhǔn)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，1 μg對照模板DNA 在37℃下反應(yīng)2 h至少可獲得150 μg以上的RNA。

4. 產(chǎn)物純化：

轉(zhuǎn)錄后的 RNA 可以選用磁珠法進(jìn)行純化，也可以采用柱純化、酚 / 氯仿純化法或氯化鋰沉淀法等，以去除蛋白、游離的核苷酸。純化后的 RNA 經(jīng)電泳檢測后可進(jìn)行下游實驗或存儲于-80℃。

(1) 磁珠純化法

按照磁珠說明書進(jìn)行純化操作。

(2) 柱純化法

純化前加入80 μl Nuclease-Free Water 將產(chǎn)物稀釋至 100 μl，再按純化柱說明書進(jìn)行純化操作。

(3) 酚 / 氯仿純化法

① 向20 μl反應(yīng)混合物中，加入115 μl Nuclease-Free Water 和15 μl 3 M乙酸鈉(pH5.2)，混合均勻。

② 加入等體積(150 μl)的酚/氯仿(1:1)混合液抽提一次，室溫以最大轉(zhuǎn)速（≥12000 rpm）離心5 min，將上層水相溶液轉(zhuǎn)移至新的RNase-free EP管中。

注：轉(zhuǎn)移上清時請勿吸到中間層。

③ 再加入等體積的氯仿抽提 2 次，收集上清，并轉(zhuǎn)移至新的 RNase-free EP 管中。

④ 加入2倍體積的無水乙醇沉淀 RNA。混合均勻后置于-20℃至少 30 min，以最大轉(zhuǎn)速（≥12000 rpm），4℃離心15 min，收集沉淀。

⑤ 加入500 μl冰預(yù)冷的70%乙醇洗滌RNA沉淀，以最大轉(zhuǎn)速（≥12000 rpm）， 4℃離心5 min，收集沉淀。

⑥ 用20 μl Nuclease-Free Water 溶解RNA 沉淀。純化后的RNA溶液于-80℃保存。

(4) 氯化鋰沉淀法

采用氯化鋰沉淀法，RNA長度至少滿足100 nt以上，且濃度不能低于100 ng/μl。

① 向20 μl反應(yīng)混合物中，加入30 μl Nuclease-Free Water和30 μl 7.5 M氯化鋰。

② 混合均勻后，置于-20℃至少30 min，以最大轉(zhuǎn)速（≥12000 rpm），4℃ 離心15 min，收集沉淀。

③ 加入500 μl冰預(yù)冷的70%乙醇洗滌RNA沉淀，以最大轉(zhuǎn)速（≥12000 rpm），4℃離心5 min，收集沉淀。

④ 用20 μl Nuclease-Free Water 溶解RNA 沉淀。純化后的RNA溶液于-80℃保存。

5. RNA 定量

(1) 紫外吸收法：

游離的NTP等會嚴(yán)重影響定量的準(zhǔn)確性，采用此方法前請先進(jìn)行RNA純化。

(2) 染料法：

可使用RNA特異熒光染料或相關(guān)試劑盒進(jìn)行RNA定量，可以對純化或者未純化的反應(yīng)產(chǎn)物中的RNA進(jìn)行定量。

6. RNA 檢測

(1) 凝膠電泳法

為了評估轉(zhuǎn)錄本的長度及質(zhì)量，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物應(yīng)選擇合適的非變性或變性瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳檢測。變性電泳下可減少RNA的二級結(jié)構(gòu)形成,通常RNA以正確大小的單個條帶遷移。

注1：電泳緩沖液和凝膠均需現(xiàn)配現(xiàn)用，使用尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時推薦用0.5× TBE電泳緩沖液電泳。

注2：轉(zhuǎn)錄完成的RNA可用Nuclease-Free Water稀釋后電泳，電泳上樣量推薦0.05~1 μg。

注3：加完RNA Loading Buffer后的樣品可于65℃處理5~10 min以減少RNA二級結(jié)構(gòu)形成。

注4：可使用Safe Red核酸染料觀察RNA電泳條帶，聚丙烯凝膠酰胺凝膠推薦用泡染法觀察條帶。

(2) 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法可數(shù)字化的精確評估RNA樣本的完整性、純度或降解程度。與凝膠法相比，此法所需RNA樣本量低，靈敏度高。

注意事項：

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

常見問題：

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