輔酶Ⅰ NAD+/NADH含量測(cè)定試劑盒 

微板法

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

煙酰胺核苷酸的測(cè)定一直是細(xì)胞或組織在能量轉(zhuǎn)化和氧化還原狀態(tài)方面的研究熱點(diǎn)。 NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要?dú)涫荏w，其N(xiāo)AD+/NADH比值的高低不僅可用于評(píng)價(jià)糖酵解和TCA循環(huán)的強(qiáng)弱，而且在生物物質(zhì)合成和抗氧化代謝中具有重要調(diào)控作用。

本試劑盒提供一種方便，快速的檢測(cè)方法，提供特異性提取液分別提取樣品中的NAD+和NADH，NADH在遞氫體作用下與一種高靈敏度的顯色劑反應(yīng)生成黃色水溶性甲瓚，在 450nm下檢測(cè)，得到NADH含量。利用乙醇脫氫酶特異性還原NAD+為NADH，從而檢測(cè)NAD+含量。

保存條件: 

-20℃保存，三個(gè)月有效。

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品使用：

建議正式實(shí)驗(yàn)前，選取2個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解實(shí)驗(yàn)樣品情況，熟悉流程，避免樣本和試劑浪費(fèi)。

一、樣本準(zhǔn)備：

1. 組織樣本準(zhǔn)備：

(a) NAD+的提取：

取約0.1g組織（水分充足樣本可取0.5g），加入1mL提取液A，冰浴研磨，全部轉(zhuǎn)移到離心管中（用提取液A補(bǔ)齊到1mL），植物樣本于95℃孵育5min或動(dòng)物樣本于60℃孵育30min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm4℃離心10min；取500μL上清液至新離心管中，再加V1體積的提取液B中和（可分次添加提取液B，調(diào)至PH約中性，記錄提取液B加入體積為V1）；12000rpm，4℃離心5min，取上清液置于冰上待測(cè)。

(b) NADH的提取：

取約0.1g組織（水分充足樣本可取0.5g），加入1mL提取液B，冰浴研磨，全部轉(zhuǎn)移到離心管中（用提取液B補(bǔ)齊到1mL），植物樣本于95℃孵育5min或動(dòng)物樣本于60℃孵育30min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4℃離心10min；取500μL上清液至新離心管中，再加V2體積的提取液A中和（可分次添加提取液A，調(diào)至PH約中性，記錄提取液A加入體積為V2）；12000rpm，4℃離心5min，取上清液置于冰上待測(cè)。

【注】：若測(cè)出值較低，可加大樣本取樣量，如增加到0.2g等，可做幾個(gè)梯度選擇適合本次實(shí)驗(yàn)的樣本量。

2. 細(xì)菌/細(xì)胞樣本準(zhǔn)備：

(a) NAD+的提取：

先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)：取約5×10⁶個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液A，冰浴研磨， 全部轉(zhuǎn)移到離心管中（用提取液A補(bǔ)齊到1mL），于60℃孵育30min，取出后立即冰浴（或 放冰箱）5min；12000rpm 4℃離心10min；取500μL上清液至新離心管中，再加V1體積的提取液B中和（可分次添加提取液B，調(diào)至PH約中性，記錄提取液B加入體積為V1）；12000rpm，4℃離心5min，取上清液置于冰上待測(cè)。

(b) NADH的提取：

先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)：取約5×10⁶個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液B，冰浴研磨，全部轉(zhuǎn)移到離心管中（用提取液B補(bǔ)齊1mL），于60℃孵育30min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4 ℃離心10min；取500μL上清液至新離心管中，再加V2體積的提取液A中和（可分次添加提取液A，調(diào)至PH約中性，記錄提取液A加入體積為V2）；12000rpm 4 ℃離心5min，取上清置于冰上待測(cè)。

【注】：若測(cè)出值較低，可加大樣本取樣量，如增至1×10⁷個(gè)等，可做幾個(gè)梯度選適合本次實(shí)驗(yàn)的樣本量。

3. 液體樣本準(zhǔn)備：

(a) NAD+的提取：

在離心管中加入約0.1mL液體樣本，然后再加入1mL提取液A（用提取液A補(bǔ)齊到1.1mL）， 于95℃孵育5min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4℃離心10min；取500μL 上清液至新離心管中，再加V1體積的提取液B中和（可分次添加提取液B，調(diào)至PH約中性， 記錄提取液B加入體積為V1）；12000rpm4℃離心5min，取上清置冰上待測(cè)。 (b) NADH的提取：

在離心管中加入約0.1mL液體樣本，然后再加入1mL提取液B（用提取液B補(bǔ)齊到1.1mL）， 于95℃孵育5min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4℃離心10min；取500μL 上清液至新離心管中，再加V2體積的提取液A中和（可分次添加提取液A，調(diào)至PH約中性， 記錄提取液A加入體積為V2）；12000rpm 4℃離心5min，取上清液置于冰上待測(cè)。

【注】：若測(cè)出值較低，可加大樣本取樣量，如增至0.5mL等，可做幾個(gè)梯度選擇適合本次實(shí)驗(yàn)的樣本量。

二、樣品測(cè)定 ：

1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30min 以上，溫度設(shè)定37℃，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至450nm。

2. 在96孔板中依次加入：

【注】若ΔA過(guò)小，可加大樣本取樣質(zhì)量W；或增加樣本量V1（由20增至40μL，則試劑三相應(yīng)減少），或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（如：60min或更長(zhǎng)）；則改變后的相應(yīng)變量需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。

三、含量計(jì)算：

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=4.2609x-0.0071：x是NADH摩爾質(zhì)量（nmol），y 是ΔA。

2. NAD+含量的計(jì)算：

(1) 按樣本鮮重計(jì)算：

NAD+(nmol/g 鮮重）=[(△A+0.0071)÷4.2609]÷(W÷2×V÷V3)=23.47×(△A+0.0071)×(0.5+V1)÷W

(2) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

NAD+(nmol/10⁴cell）=[(△A+0.0071)÷4.2609]÷(500÷2×V 樣÷V3)=0.047×(△A+0.0071)×(0.5+V1)

(3) 液體中NAD+含量計(jì)算：

NAD+含量(nmol/mL）=[(△A+0.0071)÷4.2609]÷(V 液÷2×V 樣÷V3)=234.7×(△A +0.0071)×(0.5+V1)

3. NADH含量的計(jì)算：

(1) 按樣本鮮重計(jì)算：

NADH(nmol/g 鮮重）=[(△A+0.0071)÷4.2609]÷(W÷2×V÷V4)=23.47×(△A+0.0071)×(0.5+V2)÷W

(2) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

NADH(nmol/10⁴ cell）=[(△A+0.0071)÷4.2609]÷(500÷2×V÷V4)=0.047×(△A+0.0071)×(0.5+V2)

(3) 液體中NADH含量計(jì)算：

NADH含量(nmol/mL）=[(△A+0.0071)÷4.2609]÷(V 液÷2×V樣÷V4)=234.7×(△A+0.0071) ×(0.5+V2)

V樣----加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL

V液----所取液體樣本體積：0.1mL

V3---NAD+提取液體積，0.5mL提取液A+V1mL提取液B=（0.5+V1）mL

V4---NADH 提取液體積，0.5mL提取液B+V2mL提取液A=（0.5+V2）mL

W----樣本質(zhì)量，g

500----細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)

NADH分子量----663.4

附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程：

1. 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1μmol/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品離心管里面加入1.41mL蒸餾水（NADH不太穩(wěn)定，取出NADH后請(qǐng)盡快使用。如果發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不理想，很有可能是標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)生了降解）。 

2. 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0，1，2，3，4，5 nmol/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

3. 依據(jù)測(cè)定管的加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

注意事項(xiàng)：

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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