NADH-谷氨酸合成酶(NADH-GOGAT)

活性檢測(cè)試劑盒非綠色組織 微板法 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

谷氨酸合成酶（GOGAT）一般包含兩類(lèi)：一類(lèi)是多存在于葉綠體（葉片）中的Fd-GOGAT， 另一類(lèi)是多存在于非綠色組織（根）前質(zhì)體中的NADH-GOGAT。GOGAT廣泛分布于植物中，植物吸收的無(wú)機(jī)氮經(jīng)硝酸還原糖（NR）和亞硝酸還原酶（NIR）還原成NH4+后，通過(guò)谷氨酰 胺合成酶（GOGAT）參與的GS/GOGAT途徑才能進(jìn)行氮素的同化和利用。

NADH-谷氨酸合成酶（NADH-GOGAT，EC1.4.1.14) 催化谷氨酰胺的氨基轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸，形成兩分子的谷氨酸；同時(shí)NADH氧化生成NAD+，可以通過(guò)檢測(cè)340nm吸光度的下降速率得出NADH-GOGAT的酶活性大小。

該酶催化的反應(yīng)：L-glutamine+2-oxoglutarate + NADH + H+=2 L-glutamate + NAD+。

保存條件: 

2-8℃保存，三個(gè)月有效。

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品使用：

建議正式實(shí)驗(yàn)前，選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解實(shí)驗(yàn)樣品情況，熟悉流程，避免樣本和 試劑浪費(fèi)！

一、樣本準(zhǔn)備：

1. 組織樣本：

(a) 稱(chēng)取約0.1g組織（水分充足的樣本可以取0.5g），加入1mL提取液，進(jìn)行冰浴勻漿；

(b) 12000rpm，4℃離心10min，取上清，置冰上測(cè)定。

【注】：1. 根據(jù)研究需求，可按組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例進(jìn)行提取。

2. 若樣本顏色較深（如植物葉片），可引起起始值A(chǔ)1值較大如超過(guò)1.5，可在樣本制備過(guò)程中增加除色素步驟：取約0.2g組織（水分充足的樣本可取1g），加入80%乙醇冰浴勻漿，12000rpm，4℃ 離心10min，棄掉色素較深的上清液；以上除色素步驟重復(fù)2次。最后向離心得到的沉淀中加入1mL 提取液，混勻或再次冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌/細(xì)胞樣本：

(a) 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；

(b) 取5×10⁶個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；

(c) 12000rpm，室溫離心15min，取上清測(cè)定。

【注】：若增加樣本量，可按每0.5~1×10⁷個(gè)細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量加入1mL提取液的比例進(jìn)行提取。

二、樣品測(cè)定：

1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，設(shè)定波長(zhǎng)到340nm。

2. 在96孔板中依次加入：

【注】：

1.若A1太大如超過(guò)2（如顏色較深的植物葉片，一般色素較高，則起始值相對(duì)會(huì)偏高），可以適當(dāng) 減少樣本加樣量V1（如減至10μL，另外10μL用提取液補(bǔ)齊），則改變后的V1需代入計(jì)算公式重新計(jì)算?；蛘邷p少試劑一的加樣量（如減至20μL，另外20μL用蒸餾水補(bǔ)齊）或向待測(cè)樣本中加少許活性炭混勻靜置5min后12000rpm,4℃離心10min，上清液用于檢測(cè)；

2. 若ΔA的值大于0.4，則需減少反應(yīng)時(shí)間（如減少至5min），則改變后的反應(yīng)時(shí)間T需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。

3. 若下降趨勢(shì)不穩(wěn)定，可以每隔20S讀取一次吸光值，選取一段線性下降的時(shí)間段來(lái)參與計(jì)算，相對(duì)應(yīng)的A值也代入計(jì)算公式重新計(jì)算。

三、結(jié)果計(jì)算

1. 按蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADH-GOGAT(nmol Glu/min/mg prot）=2×[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(V1×Cpr) ÷T =6430.9×ΔA÷Cpr ÷T

2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算：

單位定義：每克組織每分鐘消耗1nmol 的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADH-GOGAT（nmol Glu/min/g 鮮重）=2×[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V1÷V) ÷T =6430.9×ΔA÷W÷T

V--提取液體積，1mL

V1--加入樣本體積，0.02mL

V2--反應(yīng)總體積，2×10^-4L

ε--NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm

d--96 孔板光徑，0.5cm

W--樣本質(zhì)量，g

T--反應(yīng)時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)中是10min

Cpr---上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）

2--每合成2nmol的Glu有1nmol的NADH被氧化

注意事項(xiàng)：

 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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