NAD-蘋果酸脫氫酶(NAD-MDH)

活性檢測(cè)試劑盒(線粒體和胞質(zhì)) 分光法 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

蘋果酸脫氫酶廣泛存在于動(dòng)植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，依據(jù)需要的輔酶不同，可分為： NAD-MDH和NADP-MDH，前者主要存在于線粒體和胞質(zhì)中，后者存在于某些微生物和植物葉綠體中；蘋果酸脫氫酶與多條生理代謝途徑密切相關(guān)：線粒體的能量代謝、蘋果酸-天冬氨 酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。

NAD-MDH（EC1.1.1.37）催化NADH還原草酰乙酸生成蘋果酸，使NADH在340nm處 光吸收下降，進(jìn)而通過340nm處光吸收的下降速率計(jì)算得到NAD-MDH的酶活性大小。

保存條件: 

-20℃保存，三個(gè)月有效。

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品使用：

建議正式實(shí)驗(yàn)前，選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解實(shí)驗(yàn)樣品情況，熟悉流程，避免樣本和 試劑浪費(fèi)。

一、樣本準(zhǔn)備

1. 組織樣本：

(a) 稱取約0.1g組織，加入1mL提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。

(b) 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取。

2. 細(xì)胞/細(xì)菌樣本：

(a) 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；

(b) 取5×10⁶個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率200W，超 聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；

(c) 12000rpm 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

【注】：若增加樣本量，按照每0.5~1×10⁷個(gè)細(xì)菌/細(xì)胞加入1mL提取液進(jìn)行提取。

3. 液體樣本：

直接檢測(cè)；若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。

二、樣品測(cè)定

1. 紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 測(cè)定前將溶好的試劑一在25℃水浴鍋中孵育10min以上。

3. 在1mL石英比色皿（光徑1cm）中依次加入：

【注】1 若ΔA在零附近，可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間T（如增至10min）讀取A2；或加大樣本量V1（如增至80μL，則試劑二相應(yīng)減少）。改變后的反應(yīng)時(shí)間T或V1需代入公式重新計(jì)算。

2 若ΔA大于0.6或A2的值小于0.5，需縮短反應(yīng)時(shí)間時(shí)間T（如減至0.5min），或減少樣本量V1（如 減至10μL，則試劑二相應(yīng)增加），則改變后的T和V1需代入公式重新計(jì)算。

3 若起始值A(chǔ)1太大如超過2（顏色較深的植物葉片，一般色素較高則起始值相對(duì)會(huì)偏高），可減少 V1（如減至10μL，則試劑二相應(yīng)增加），則改變后的V1代入公式重新計(jì)算?；蛳虼郎y(cè)樣本中加少許活性炭混勻靜置5min后12000rpm,4℃離心10min，上清液用于檢測(cè)；

4 若下降趨勢(shì)不穩(wěn)定，可以每隔10S讀取一次吸光值，選取一段線性下降的時(shí)間段來參與計(jì)算，相對(duì)應(yīng)的A值也代入公式重新計(jì)算。

三、結(jié)果計(jì)算

1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷T=3215.4×ΔA÷Cpr

2. 按樣本鮮重計(jì)算：

酶活定義：每克組織中每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V1÷V)÷T =3215.4×ΔA÷W

3. 按細(xì)菌/細(xì)胞密度計(jì)算：

酶活定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V1÷V)÷T=6.43×ΔA

4. 按液體體積計(jì)算：

酶活定義：每毫升液體每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷V1÷T=3215.4×ΔA

ε---NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm

d---96 孔板光徑，1cm

V---加入提取液體積，1mL

V1---加入樣本體積，0.04mL

V2---反應(yīng)體系總體積，8×10^-4L

T---反應(yīng)時(shí)間，1min

500---細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，萬

W---樣本質(zhì)量，g

Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL

注意事項(xiàng)：

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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