NADH氧化酶(NOX)

活性檢測(cè)試劑盒 分光法 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

NADH氧化酶（NOX，EC1.6.99.3）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，可在氧氣存在下，直接將NADH氧化為NAD。該酶不僅參與NAD的再生，而且與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。

NOX能夠?qū)ADH氧化為NAD，通過(guò)檢測(cè)NADH于340nm處的下降速率，即可得出NADH氧化酶活性的大小。

保存條件: 

-20℃保存，3個(gè)月有效。

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品使用：

建議正式實(shí)驗(yàn)前，選取2個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解實(shí)驗(yàn)樣品情況，熟悉流程，避免樣本和試 劑浪費(fèi)！

一、線粒體制備（提示：整個(gè)線粒體的提取過(guò)程須保持4℃低溫環(huán)境）

1. 稱取約0.2g組織或收集1000萬(wàn)細(xì)菌/細(xì)胞，加入1mL試劑一，用冰浴勻漿器或研缽冰浴勻漿，轉(zhuǎn)移至離心管后于4℃×3000g離心20min；

2. 小心吸取上清液（棄沉淀）移至另一離心管中，4℃×16000g離心20min。用移液器移除上清液（上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的NOX（此步可選做））。 留下沉淀（沉淀即為線粒體）。

3. 在沉淀（線粒體）中加入200μL試劑二，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲5s，間隔3s，重復(fù)30次），液體置于冰上用于線粒體NOX酶活性測(cè)定。

【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例進(jìn)行提取，或按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（10⁴）：提取液（mL）為500~1000：1的比例進(jìn)行提取。

二、樣品測(cè)定

1. 紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，設(shè)定溫度25℃，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 所有試劑解凍至室溫（25℃）。

3. 在1mL石英比色皿（光徑1cm）中依次加入：

【注】若△A小于0.01，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間T（如至10min或更長(zhǎng)），則改變后的反應(yīng)時(shí)間T需代入公式重新計(jì)算。

三、含量計(jì)算

1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘氧化1nmolNADH定義為一個(gè)酶活單位。

NOX(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×10⁹]÷(V1×Cpr)÷T=396.6×ΔA÷Cpr

2. 按樣本鮮重計(jì)算：

酶活定義：每克組織每分鐘氧化1nmolNADH定義為一個(gè)酶活單位。

NOX(nmol/min/g鮮重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×10⁹]÷(W×V1÷V)÷T=79.3×ΔA÷W

3. 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

酶活定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘氧化1nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA÷(ε×d)×V2×10⁹]÷(500×V1÷V)÷T=0.16×ΔA

ε---NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm

d---1cm

V---加入試劑二的體積，0.2mL

V1---加入樣本體積，0.06mL

V2---反應(yīng)體系總體積，7.4×10^-4L

T---反應(yīng)時(shí)間，5min

W---樣本質(zhì)量，g

500---細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，萬(wàn)

Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL

注意事項(xiàng)：

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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