NAD-蘋果酸脫氫酶(NAD-MDH)

活性檢測試劑盒(線粒體和胞質) 微板法 

產品簡介：

蘋果酸脫氫酶廣泛存在于動植物、微生物和培養細胞中，依據需要的輔酶不同，可分為: NAD-MDH 和NADP-MDH，前者主要存在于線粒體和胞質中，后者存在于某些微生物和 植物葉綠體中；蘋果酸脫氫酶與多條生理代謝途徑密切相關:線粒體的能量代謝、蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統、活性氧代謝和抗病性等。

NAD-MDH(EC1.1.1.37)催化 NADH 還原草酰乙酸生成蘋果酸，使NADH在340nm處光吸收下降，進而通過340nm處光吸收的下降速率計算得到NAD-MDH的酶活性大小。

保存條件: 

-20℃保存，三個月有效。

產品組成：

產品使用：

建議正式實驗前，選取2個樣本做預測定，了解實驗樣品情況，熟悉流程，避免樣本和 試劑浪費！

一、樣本準備

1. 組織樣本：

(a) 稱取約0.1g組織，加入1mL提取液，進行冰浴勻漿；

(b) 12000rpm，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

【注】：若增加樣本量,可按組織質量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例提取

2. 細菌/細胞樣本：

(a) 先收集細胞或細菌到離心管內，離心后棄上清；

(b) 取5×10⁶個細胞或細菌加入1mL提取液，超聲波破碎細胞或細菌（冰浴，功率200w，超 聲3s，間隔10s，重復30次）；

(c) 12000rpm，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

【注】：若增加樣本量，可按每0.5~1×10⁷個細菌數量加入1mL提取液的比例進行提取。

二、樣品測定

1. 酶標儀預熱30min，設定波長到340nm。 

2. 測定前將溶解好的試劑一在25℃水浴中孵育10min以上。

3. 在96孔板中依次加入：

【注】：1. 若ΔA在零附近，可延長反應時間 T(如增至10min)讀取 A2；或加大樣本量V1(如增至30μL，則試劑二相應減少)。改變后的反應時間T或 V1需代入公式重新計算。

2. 若ΔA大于0.6或A2的值小于0.5，需縮短反應時間時間T(如減至0.5min)，或減少樣本量 V1(如減至5μL，則試劑二相應增加)，則改變后的T和V1 需代入公式重新計算。

3. 若起始值A1太大如超過2(顏色較深的植物葉片，一般色素較高則起始值相對會偏高),可減少V1(如減至5μL，則試劑二相應增加)，則改變后的 V1代入公式重新計算。或向待測樣本中加少許活性炭混勻靜置5min后12000rpm,4℃離心10min,上清液用于檢測。

4. 若下降趨勢不穩定，可以每隔10S 讀取一次吸光值，選取一段線性下降的時間段來參與計算，相對應的A值也代入公式重新計算。

三、結果計算

1. 按樣本蛋白濃度計算：

酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(V1×Cpr)÷T =6430.9×ΔA÷Cpr

2. 按樣本鮮重計算：

酶活定義：每克組織在每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V1÷V)÷T=6430.9×ΔA÷W

3. 按細菌/細胞密度計算：

酶活定義：每10⁴個細菌或細胞每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V1÷V)÷T=12.86×ΔA

4. 按液體體積計算：

酶活定義：每毫升液體每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷V1÷T=6430.9×ΔA

V--提取液體積，1mL

V1--加入樣本體積，0.01mL

V2--反應體系總體積，2×10^-4L

ε--NADH 摩爾消光系數，6.22×10³L/mol/cm

d--光徑，0.5cm

W--樣本質量，g

500--細胞數量，萬

T--反應時間，1min

Cpr--蛋白濃度（mg/mL）

注意事項：

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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